His標(biāo)簽蛋白純化填料（帶柱子）

2-8℃

避免冷凍。

一年

1.離心機(jī)
2.振蕩器
3.渦旋混勻器
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒

1.純水

1.離心管
2.吸頭

1.樣品中不能含有β-巰基乙醇、DTT和EDTA、EGTA等。
2.整個(gè)純化過(guò)程中切忌凝膠脫水變干。
3.為提高純化效率，首先確定Binding Buffer和Elution Buffer中咪唑的使用濃度。必要時(shí)可以使用線性或梯度濃度的咪唑濃度，Binding Buffer的范圍為0-10 mM，洗脫緩沖液的范圍為10-500 mM來(lái)進(jìn)行。并通過(guò)SDS-PAGE或Western Blotting來(lái)檢測(cè)目的蛋白的純度。
4.請(qǐng)使用高純度的試劑配制緩沖液，并通過(guò)0.22 μm或者0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾。為避免柱子被堵塞，建議將裂解液進(jìn)行離心，或者使用0.22 μm或者0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾。
5.柱再生時(shí)，保證每步洗完后都要用足夠的去離子水沖洗至中性。

填料參數(shù)：
填料體積： 10 ml
動(dòng)態(tài)吸附量： 20 mg 6×His 標(biāo)簽蛋白（27 kD）/ml 介質(zhì)
球形基質(zhì)： 4 %交聯(lián)度瓊脂糖
平均粒徑： 90 μm （45‐165 μm）
儲(chǔ)存溶劑： 1× PBS（含20%乙醇）

天然條件下純化多聚標(biāo)簽蛋白
緩沖液配制
用于配制緩沖液的水和化學(xué)試劑必須是高純度的，并建議使用前用0.45 μm 濾膜過(guò)濾一遍。
平衡緩沖液：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，用NaOH 調(diào)pH 為8.0
洗滌緩沖液：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，10 mM 咪唑，用NaOH 調(diào)pH 為8.0
洗脫緩沖液：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，250 mM 咪唑，用NaOH 調(diào)pH 為8.0

組裝層析柱
1． 將Ni-Agarose Resin填料混勻后加入層析柱，室溫靜置10分鐘，待凝膠與溶液分層后，把底部的出液口打開(kāi)，讓乙醇通過(guò)重力作用緩慢流出。
2． 向裝填好的柱中加入5倍柱體積的去離子水將乙醇沖洗干凈后，再用10倍柱體積的Binding Buffer平衡柱子，平衡結(jié)束后即可上樣。

可溶性蛋白的純化
以下以可溶性蛋白純化為例，使用時(shí)以實(shí)際樣本為準(zhǔn)。

1． 收集菌體后，每100 mg菌體（濕重）加入1-5 ml細(xì)菌裂解液（每1 ml 細(xì)菌抽提試劑中已加入10 μl 蛋白酶抑制劑混合物），超聲裂解菌體。
2． 10000 rpm,4℃離心3分鐘，收集上清中的可溶性蛋白。
3． 用Binding Buffer將菌體裂解液等倍稀釋后負(fù)載上柱，流速為10倍柱體積/小時(shí)，收集流穿液。
4． 使用15倍柱體積的Binding Buffer沖洗柱子，洗去雜蛋白。
5． 使用適量Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰。
6． 洗脫后，依次使用10倍柱體積的去離子水洗滌柱子，再用3倍柱體積的20%乙醇平衡（乙醇要將填料浸沒(méi)），封柱后2-8℃保存。

柱再生
當(dāng)填料使用多次后，結(jié)合效率會(huì)有所下降（表現(xiàn)為流速變慢或填料失去藍(lán)綠色），可以用以下方法再生，提高填料的使用壽命和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率。
1． 使用2倍柱體積的6 M鹽酸胍沖洗后，使用3倍柱體積的去離子水沖洗。
2． 使用1倍柱體積的2% SDS沖洗。
3． 依次使用1倍柱體積的25%、50%、75%和5倍柱體積的99%乙醇沖洗，再依次使用1倍柱體積的75%、50%和25%的乙醇沖洗。
4． 使用1倍柱體積的去離子水沖洗。
5． 使用5倍柱體積含50 mM EDTA緩沖液（PH8.0）沖洗。
6． 使用3倍柱體積去離子水，3倍柱體積20%乙醇沖洗。
7． 置2-8°C保存。
8． 再次使用前，需首先使用10倍柱體積去離子水沖洗，然后使用5個(gè)柱體積的50 mM NiSO4再生，3個(gè)柱體積的Binding Buffer平衡。
9． 為了長(zhǎng)時(shí)間的保存，介質(zhì)應(yīng)當(dāng)2‐8 ℃保存在1× PBS（含20 % 乙醇）中。

His標(biāo)簽蛋白純化過(guò)程，經(jīng)常出現(xiàn)的問(wèn)題包括幾個(gè)方面：
1、 純化的組分中沒(méi)有His標(biāo)簽的蛋白?
2、 HIS標(biāo)簽蛋白洗脫后雜帶較多?
我們可以根據(jù)檢測(cè)上柱前蛋白，流穿液蛋白，和洗脫液蛋白的檢測(cè)，來(lái)進(jìn)行基本的判斷。是否包涵體蛋白？是否標(biāo)簽沒(méi)有表達(dá)出來(lái)：可能是因?yàn)檎郫B構(gòu)象不正確導(dǎo)致標(biāo)簽在重折疊時(shí)沒(méi)有位于蛋白質(zhì)分子的表面上無(wú)法與離子柱結(jié)合；或者標(biāo)簽在折疊時(shí)沒(méi)有位于蛋白質(zhì)分子的表面上；蛋白不溶解或沉淀在柱子上：要留意緩沖液體的pH，此外在樣品中添加一些表面活性劑甚至乙醇等有機(jī)溶劑可以增加疏水性蛋白的溶解度，對(duì)于帶半多的蛋白很容易氧化聚集沉淀，所以需要加2-5mM巰基乙醇避免沉淀。