糖蛋白富集試劑盒

2-8℃

1.蛋白酶抑制劑未開蓋使用前也可以2-8℃儲存。開蓋使用后-20℃儲存。
2.蛋白酶抑制劑在2-8℃低溫時是固體狀態(tài)，從冰箱取出后恢復(fù)至室溫或37℃短時間水浴，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。
3.試劑拆封后請盡快使用完！

一年

WB,IP等

動物細胞/組織

本試劑盒純化柱參數(shù)：
特點：基團脫落少，結(jié)合特異性強
配基密度：20μmol/ml
吸附載量：1mg Con A /柱
流速：300cm/h
pH范圍：3-10，在位清洗時pH范圍可到2-13
使用溫度：4℃~常溫
保存溫度：+4~8℃

WB,IP等

1.離心機
2.振蕩器
3.勻漿機/勻漿器
4.渦旋混勻器
5.移液器
6.冰箱
7.冰盒

1.PBS緩沖液
2.蛋白定量試劑盒

1.離心管
2.吸頭
3.一次性手套

使用注意事項：
? 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。
? 實驗過程中的所有試劑須預(yù)冷；所有器具須放-20℃冰箱預(yù)冷。整個過程須保持樣品處于低溫。
? 蛋白酶抑制劑儲存期間溶液如果出現(xiàn)沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。
? 蛋白樣品中不可含Tris。
? 蛋白樣品不可以含有三乙醇胺類的物質(zhì)。
? 蛋白樣品中可以含有二價陽離子、非離子表面活性劑。
? 上樣蛋白樣品pH值必須高于8，在8-9，蛋白濃度在0.25-0.5mg/ml。
? 洗滌細胞和組織是不能用Tris緩沖液。
? 每個新柱的載量約為1mg糖蛋白，使用過的柱子經(jīng)過再生反復(fù)使用的，載量會有下降。
? 用蛋白柱進行糖蛋白富集，需要離心操作時可以將蛋白柱置于一個50ml離心管離心即可。
? 最終蛋白樣品用于2D電泳前需脫鹽。

一、蛋白樣品的準備：
以下為由細胞和組織制備蛋白樣品的參考步驟。
其它方法得到的蛋白樣品稀釋至蛋白濃度為0.25-0.5mg/ml后直接上樣即可，確保蛋白樣品的pH值高于8，并且蛋白樣品中不含Tris和高濃度糖。
可以用試劑盒中的洗柱液、裂解液、洗滌液稀釋蛋白樣品。

細胞裂解：
1. 提取液制備：
每500μl冷的裂解液中加入2μl蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
2. 取5-10×106個細胞，在4℃，1000g條件下離心5-10分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸干，收集細胞。
3. 用冷生理鹽水洗滌細胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。
4. 每5×106個細胞或100mg組織樣本中加入500μl冷的蛋白裂解液，混勻后，用勻漿器充分勻漿，至無明顯肉眼可見固體。
5. 將勻漿液在4℃條件下振蕩15-30分鐘。
6. 在4℃，14000g條件下離心15分鐘。
7. 快速將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，即可得到總蛋白裂解液。

二、柱平衡：
加入500μl洗柱液洗柱，重力作用下或4℃下500×g力離心1分鐘甩干吸附柱。
再次加入500μl洗柱液洗柱，重力作用下或4℃下500×g力離心1分鐘甩干吸附柱。

三、上樣：
將以上蛋白裂解液或其它待富集蛋白樣品加入吸附柱，重力作用下或4℃下500×g力離心1分鐘甩干吸附柱。

四、洗柱：
加入300μl洗滌液洗柱，重力作用下或4℃下500×g力離心1分鐘甩干吸附柱。
重復(fù)兩次。

五、洗脫：
加入300μl糖蛋白洗脫液，重力作用下或4℃下1000×g力離心1分鐘甩干吸附柱，收集洗脫液。
再次加入300μl糖蛋白洗脫液，重力作用下或4℃下1000×g力離心1分鐘甩干吸附柱，收集洗脫液，合并兩次的洗脫液，即得到糖蛋白。

六、柱保存和柱再生：
載量大幅降低后，需要再生使用的柱子，可以用1ml 0.1M Tris-HCl（pH5.0）緩沖液洗柱，然后用300μl 0.5M NaOH含2M NaCl流洗，最后用500μl 20%乙醇洗即可。然后在柱中加入20%乙醇溶液密封，置2-8℃保存。

再生使用時，加入500μl pH8.5磷酸鹽緩沖液，浸泡蛋白柱填料30分鐘，然后用2ml pH8.5磷酸鹽緩沖液洗柱即可。

1.柱壓升高，液體不流穿或較難離心下來？
柱床被壓縮或柱使用時間過長或樣品固體雜質(zhì)較多。
注意上樣樣品要在16000×g離心15分鐘，有條件可以用0.45um膜過濾后再上樣，不能將固體雜質(zhì)上入蛋白柱。
使用次數(shù)過多后要更換蛋白柱。