活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒（calceinAM/EthD-3）

-20℃ 避光保存

一年

流式細(xì)胞儀/熒光顯微鏡 /激光共聚焦

細(xì)胞

流式細(xì)胞儀/熒光顯微鏡 /激光共聚焦

?流式細(xì)胞儀/熒光顯微鏡/激光共聚焦 ?離心機(jī) ?移液器 ?冰箱 ?冰盒

?PBS緩沖液 ?或者HBSS

?離心管 ?吸頭 ?一次性手套

?螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。 ?細(xì)胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞。 ?試劑A為DMSO溶液，冬季氣溫較低時(shí)在室溫時(shí)為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。融解后離心至管底部再打開(kāi)螺旋蓋。 ?試劑A為了便于觀察防止誤操作導(dǎo)致?lián)p失，在試劑盒中時(shí)是采用透明管包裝，收到后可以離心移入干燥黑色避光密封管或者用鋁箔包裹避光。 ?由于Calcein-AM的穩(wěn)定性比較差，染色工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，并且在當(dāng)天用完。 ?Calcein-AM對(duì)濕度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必須緊緊密封蓋子。建議根據(jù)單次用量，分裝密封保存。不可使用含水的吸頭。 ?試劑A母液請(qǐng)擰緊螺旋蓋，避免受潮失效。 ?染色液A為DMSO溶液，冬季氣溫較低時(shí)在室溫時(shí)為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。 ?以下實(shí)驗(yàn)步驟僅供參考，以實(shí)際的樣本和文獻(xiàn)參考步驟進(jìn)行調(diào)整。可以染色懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、貼壁細(xì)胞、制備的細(xì)胞爬片、涂片等原位染色。

1.染色工作液的配制： 根據(jù)樣品數(shù)按下列比例配制染色工作液。 用染料稀釋液試劑C將染色液A和B分別10倍稀釋。 每10ml HBSS緩沖液或無(wú)血清培養(yǎng)基中加入100μl稀釋過(guò)的染色液A，充分混勻，即成染色工作液A。 每10ml HBSS緩沖液或無(wú)血清培養(yǎng)基中加入20-200μl稀釋過(guò)的染色液B，充分混勻，即成染色工作液B。 2.收集樣本細(xì)胞。 【注】： ?根據(jù)下游檢測(cè)儀器和應(yīng)用需要，貼壁細(xì)胞時(shí),可以先用-EDTA等消化細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液。也可以直接原位染色檢測(cè)。 3.用PBS洗滌細(xì)胞兩次。 【注】： ?由于培養(yǎng)基中的血清等含有酯酶，導(dǎo)致Calcein-AM遇水會(huì)分解，會(huì)導(dǎo)致空白上升，所以需要用PBS洗滌數(shù)次直到洗凈。 ?貼壁細(xì)胞可以原位染色，注意吸除培養(yǎng)基前用培養(yǎng)板離心機(jī)離心，防止丟掉漂浮的死細(xì)胞。PBS洗滌時(shí)也需要離心培養(yǎng)板。 4.用200μl染色工作液A將細(xì)胞重懸。 【注】： ?Calcein-AM溶液和EthD-I溶液分開(kāi)進(jìn)行染色，先用Calcein-AM染色，再用EthD-I染色。 ?有時(shí)候可添加一定量的非離子表面活性劑如Pluronic F127到Calcein AM內(nèi)來(lái)增強(qiáng)其水溶性。制備染色工作液前，取一管需要用的Calcein AM內(nèi)加入20% Pluronic F127，使Pluronic F127的終濃度為0.02%。 ?含Pluronic F127的Calcein AM溶液不可長(zhǎng)期保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。 5.在室溫或37℃避光孵育15-20分鐘。 6.用PBS洗滌細(xì)胞。 【注】： ?如有必要，使用含有陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑的緩沖液來(lái)進(jìn)行細(xì)胞清洗。 7.用200μl染色工作液B將細(xì)胞重懸。 8.在室溫或37℃避光孵育2-5分鐘。 9.用PBS洗滌細(xì)胞。 10.用適量PBS重懸細(xì)胞。 11.用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。激發(fā)為490nm，發(fā)射波長(zhǎng)為515nm和617nm。 結(jié)果分析 ： 熒光顯微鏡下，使用490±10nm波長(zhǎng)激發(fā)，活細(xì)胞為黃綠色，死細(xì)胞為紅色。 用528 nm波長(zhǎng)激發(fā)，能夠看到紅色的死細(xì)胞。

?所有細(xì)胞都染上紅色？ EthD-3濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致活細(xì)胞也被染色，需要優(yōu)化EthD-3的使用濃度，稀釋至僅對(duì)死細(xì)胞核染色，而不會(huì)對(duì)細(xì)胞質(zhì)染色的工作濃度。 ?細(xì)胞被同時(shí)染上綠色和紅色？ 樣本中有大量晚期凋亡細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞胞漿會(huì)有Calcein著色并呈碎片狀，而且EthD-I也為陽(yáng)性。